PCR, nyaéta réaksi ranté polimérase, nu nujul kana tambahan dNTP, Mg2+, faktor elongation jeung faktor ningkatna amplifikasi kana sistem dina katalisis DNA polimérase, ngagunakeun DNA indungna salaku citakan jeung primers husus salaku titik awal extension , Ngaliwatan léngkah denaturasi, annealing, extension, jeung sajabana, prosés in vitro replicating putri strand DNA pelengkap DNA strand template indungna bisa gancang sarta husus ngagedékeun sagala target DNA in vitro.
1. Panas Mimitian PCR
Waktu mimiti amplifikasi dina PCR konvensional henteu nempatkeun mesin PCR kana mesin PCR, teras program mimiti ngagedékeun.Nalika konfigurasi sistem réngsé, amplifikasi dimimitian, anu tiasa nyababkeun amplifikasi non-spésifik, sareng PCR hot-start tiasa ngabéréskeun masalah ieu.
Naon PCR mimiti panas?Saatos sistem réaksi disiapkeun, modifier énzim dileupaskeun dina suhu luhur (biasana langkung luhur ti 90 ° C) salami tahap pemanasan awal réaksi atanapi tahapan "panas mimiti", supados polimérase DNA diaktipkeun.Waktos aktivasina sareng suhu pasti gumantung kana sifat polimérase DNA sareng modifier hot-start.Metoda ieu utamana ngagunakeun modifiers kayaning antibodi, ligan afinitas, atawa modifiers kimiawi pikeun ngahambat aktivitas DNA polimérase.Kusabab kagiatan DNA polimérase dipeungpeuk dina suhu kamar, téhnologi mimiti panas nyadiakeun genah hébat pikeun Nyiapkeun sababaraha sistem réaksi PCR dina suhu kamar tanpa sacrificing spésifisitas réaksi PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) nyaéta téknik ékspérimén pikeun transkripsi ngabalikeun tina mRNA kana cDNA sarta ngagunakeun éta salaku citakan pikeun amplifikasi.Prosedur ékspérimén nyaéta ékstrak RNA total dina jaringan atawa sél heula, ngagunakeun Oligo (dT) salaku primer, ngagunakeun reverse transcriptase pikeun nyintésis cDNA, lajeng ngagunakeun cDNA salaku template pikeun amplifikasi PCR pikeun ménta gén target atawa ngadeteksi ekspresi gén.
3. PCR kuantitatif fluoresensi
PCR kuantitatif fluoresensi (PCR kuantitatif nyata-waktos,RT-qPCR) nujul kana métode nambahkeun grup fluoresensi kana sistem réaksi PCR, ngagunakeun akumulasi sinyal fluoresensi pikeun ngawas sakabéh prosés PCR sacara real waktu, sarta tungtungna ngagunakeun kurva baku pikeun quantitatively nganalisis template.Metodeu qPCR anu biasa dianggo kalebet SYBR Green I sareng TaqMan.
4. Nested PCR
PCR Nested nujul kana pamakéan dua sét primers PCR pikeun dua rounds amplifikasi PCR, sarta produk amplifikasi tina babak kadua nyaéta fragmen gén target.
Lamun teu cocog tina pasangan primers kahiji (primer luar) ngabalukarkeun produk non-spésifik jadi amplified, kamungkinan wewengkon non-spésifik sarua dipikawanoh ku pasangan primers kadua jeung terus ngagedekeun pisan leutik, jadi amplifikasi ku pasangan primer kadua, spésifisitas PCR parantos ningkat.Hiji kauntungan tina ngajalankeun dua rounds PCR nyaéta yén éta mantuan pikeun ngagedékeun produk cukup tina DNA awal kawates.
5. PCR touchdown
Touchdown PCR mangrupikeun metode pikeun ningkatkeun spésifisitas réaksi PCR ku cara nyaluyukeun parameter siklus PCR.
Dina touchdown PCR, suhu annealing pikeun sababaraha siklus munggaran diatur sababaraha derajat di luhur suhu annealing maksimum (Tm) tina primers.Suhu annealing anu langkung luhur sacara efektif tiasa ngirangan amplifikasi non-spésifik, tapi dina waktos anu sami, suhu annealing anu langkung luhur bakal nganyenyerikeun pamisahan primer sareng sekuen udagan, nyababkeun panurunan dina ngahasilkeun PCR.Ku alatan éta, dina sababaraha siklus kahiji, suhu annealing biasana disetel ka turun ku 1 ° C per siklus pikeun ngaronjatkeun eusi gén target dina sistem.Nalika suhu annealing diturunkeun ka suhu optimum, suhu annealing dijaga pikeun siklus sésana.
6. PCR langsung
PCR langsung ngarujuk kana amplifikasi DNA target langsung tina sampel tanpa peryogi isolasi sareng purifikasi asam nukléat.
Aya dua jinis PCR langsung:
métode langsung: nyandak jumlah leutik sampel sarta tambahkeun langsung ka PCR Master Campur pikeun idéntifikasi PCR;
métode cracking: sanggeus sampling sampel, tambahkeun ka lysate nu, lyse ngaleupaskeun génom, nyandak jumlah leutik supernatant lysed tur nambahkeun kana PCR Master Campur, ngalakukeun idéntifikasi PCR.Pendekatan ieu nyederhanakeun alur kerja ékspérimén, ngirangan waktos langsung, sareng ngahindarkeun leungitna DNA salami léngkah-léngkah purifikasi.
7. BUMN PCR
Penyambungan gen ku PCR sambungan tumpang tindih (SOE PCR) ngagunakeun primers kalawan tungtung pelengkap pikeun nyieun produk PCR ngabentuk ranté tumpang tindihna, ku kituna dina réaksi amplifikasi saterusna, ngaliwatan perluasan ranté tumpang tindihna, sumber béda téhnik A nu fragmen amplified tumpang tindih. sareng dihijikeun.Téknologi ieu ayeuna gaduh dua arah aplikasi utama: pangwangunan gén fusi;mutasi gén situs-diarahkeun.
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) ngagunakeun primer komplementer tibalik pikeun ngagedékeun fragmen DNA salian ti dua primer, sarta ngagedékeun runtuyan nu teu dipikanyaho dina kadua sisi fragmén DNA nu dipikawanoh.
IPCR asalna dirancang pikeun nangtukeun runtuyan wewengkon kanyahoan padeukeut, sarta lolobana dipaké pikeun diajar runtuyan promoter gén;penyusunan ulang kromosom onkogenik, sapertos fusi gen, translokasi sareng transposisi;jeung integrasi gén viral, ogé ilahar dipaké kiwari Pikeun mutagenesis situs-diarahkeun, nyalin plasmid kalawan mutasi nu dipikahoyong.
9. dPCR
Digital PCR (dPCR) nyaéta téknik pikeun kuantifikasi mutlak molekul asam nukléat.
Ayeuna aya tilu cara pikeun ngitung molekul asam nukléat.Fotométri dumasar kana nyerep molekul asam nukléat;PCR kuantitatif fluoresensi nyata-waktos (Real Time PCR) dumasar kana nilai Ct, sareng nilai Ct nujul kana jumlah siklus anu pakait sareng nilai fluoresensi anu tiasa dideteksi;PCR digital nyaéta téknologi Kuantitatif panganyarna dumasar kana métode PCR molekul tunggal pikeun ngitung kuantitatif asam nukléat nyaéta métode kuantitatif mutlak.
waktos pos: Jun-13-2023